徕卡显微镜柯勒照明的结构图及校准方法

Koehler照明的技术是在任何给定的实现高清成像的重要的和基本技术之一光学显微镜设置。尽管通常应将其用作设置显微镜的一部分，但许多显微镜学家却认为正确的设置既复杂又费时，因而推迟了使用，因此仍然没有得到广泛应用。通过了解实际上在此技术中已调整过的显微镜的两个主要组件（隔膜和次级聚光镜），正确的设置只需几分钟。正确对齐的显微镜可以大大改善图像的均匀对比度和照明度，以及更高的分辨率和更多细节。除了如何通过五个简单的步骤调整组件之外，我们还将在本文中介绍该技术的历史。

Koehler照明技术以其发明者August Koehler（1866-1948）的名字命名，该发明者于1893年发表了该方法。在出版之时，大多数显微镜都依靠镜子和煤气灯作为照明源。加上使用显微镜进行研究的事实，研究人员正在使用需要长时间曝光的乳胶板，这通常会导致不一致。

在1893年发表于科学显微学和显微技术杂志（“显微照相的新照明系统”）和《科学显微学》上的名为“用于显微照相的新照明技术”的论文中显微学家当时面临的主要问题。Auer气体灯和氧化锆灯是该时代可用的主要照明光源，但它们倾向于产生有害的“眩光”。

Auer气体灯以奥地利科学家和发明家Baron Carl Auer von Welsbach（1858-1929）的名字命名。他因在整个欧洲用作街道照明的燃气罩获得了专利而闻名。尽管Auer气体灯仍会产生碳酸和一定量的热量，但《伦敦天然气照明和卫生供水杂志》称Auer灯“非常适合”显微镜检查。

替代的氧化锆光是通过加热元素锆产生的强化学光源。但是，使用这种光源，科勒宣称“很难或不可能实现均匀的照明”。Koehler意识到，为了保持照明的一致性，需要考虑显微镜的每个组件，并将它们彼此正确对齐。通过调节隔膜和聚光镜，他克服了过热和光线一致性的主要问题（甚至使用了操作镜来代替凸透镜！）。

即使在今天，他的一致照明技术仍被广泛使用，并构成许多技术的基础，包括共聚焦，相差和微分干涉对比（DIC）显微镜。一旦您知道如何为正确的Koehler照明设置显微镜，它就会成为第二自然，并将改变您的成像工作。它只是光学显微镜的原理之一。

设置显微镜以进行科勒照明只需不到一分钟的时间。这将确保光源均匀照射样品，产生更清晰的图像，并增加染色区域之间或切片中组织区域之间的对比度。您还将能够从每个样本中收集更多的成像数据。

如果您需要将图像用于Powerpoint演示文稿，海报演示文稿或提交给日记本，则必须使用Koehler照明。这种简单的五步技术可以走很长一段路，并且只需少量实践，在捕获图像之前就很容易成为第二自然。

除显微镜物镜外，Koehler照明还应注意其他两个组件（并对其进行了调整）。

“视场光阑”通常位于仪器的底部（在正置显微镜中），作为显微镜主体的一部分（图1）。一些更旧（或更简单）的显微镜可能只是为光源设置了“开/关”开关，并且可能没有视场光阑来控制来自光源的光强度。视场光阑只是控制到达载物台上的幻灯片的光量。通过控制来自光源的光量，您可以减少来自光源的眩光，从而获得具有更高对比度的图像。视场光阑通常由镜头周围的滚花环控制。

图1：正置显微镜的主要组件。视场光阑控制来自光源的光强度。聚光器将来自光源的光聚焦在样品上。孔径光阑控制照明光锥的角度。

台下聚光镜（图1）位于正置显微镜的平台正下方（或在平台上方，但在倒置显微镜中位于光源/视场光阑之前）。尽管它的聚焦轮类似于显微镜的精细/粗聚焦，但是该组件用于聚焦来自光源/视场光阑的光，而不是使您的样本聚焦。

“次级聚光器”收集来自光源的大部分光，并将其作为成像光锥聚集在显微镜载物台上的载玻片上。正确调节该聚光镜后，照亮样品并进入物镜的光将得到充分优化。这在图像中产生均匀的强度和对比度。由于显微镜的每个物镜都是不同的，这意味着在更改放大倍数时需要调节次级聚光镜。

在子级聚光器内，有两个组成部分，可在设置正确的Koehler照明时进行调整。这些是定心螺丝和视场光阑。与场光阑一样，子级聚光镜也有一个调光光阑，类似于场光阑，它可以通过围绕聚光镜的滑动控制或滚花环来调节。该光圈控制照射样品的光锥的角度。正如我在关于数值孔径的文章中提到的那样（NA），整个显微镜系统的NA不仅取决于物镜。实际上，当打开二级聚光镜视场光阑时，这会增加整个仪器的NA，从而带来更高的分辨率，对比度和优良照明。定心螺钉可确保用于照亮幻灯片的光直接位于视场的中心，从而在整个样本上提供均匀的强度。

开始成像之前，请务必检查镜头，目镜和物镜是否干净。显微镜镜头的清洁，但是您应始终使用镜头清洁纸和推荐的溶剂。将幻灯片放在载物台上，然后将灯泡打开到最低位置。

聚焦样品，但请记住，如果您在共享设施中使用仪器，则显微镜设置可能会完全错位。首先，关闭视场光阑，该光阑在正置显微镜中位于仪器基座上，在倒置显微镜中位于聚光镜上方。当您俯视目镜时，您现在将在幻灯片上看到一小圈光（图2）。

图2：关闭视场光阑。

现在聚焦聚光镜。当您坐在显微镜旁时，聚光镜的调节轮通常位于聚焦轮的前面。向上和向下移动聚光镜，同时俯视目镜。您会看到，光圈的边缘将进入和聚焦不清晰（并从红色条纹变为蓝色条纹）。使光圈的边缘尽可能锐利（图3）。

图3：聚焦聚光镜。

一旦有了清晰的光圈，就将目光从目镜移开，然后看一下显微镜的聚光镜组件。您会看到对中螺钉。您可以在隔膜关闭或几乎完全打开的情况下使聚光镜居中。我通常将聚光镜与视场光阑对准中心，在上面的第二步中将其留在其中，几乎完全关闭。拧紧螺丝的同时，再次向下看目镜。慢慢旋转螺钉时，您会看到光圈将在视场中移动。您应该力求使圆位于样品视图的中间（图4）。

图4：将聚光镜居中。

将聚光镜居中后，打开视场光阑，直到光圈的边缘从视野中消失为止（图5）。 

图5：打开视场光阑。

（5）最后的调节是使用光圈（或光圈）光圈。在对中螺丝下方（或在倒置显微镜上方），您会发现另一个类似于主视野光阑的光阑。在俯视目镜的同时，将其完全打开，然后再将其关闭直到图像“眩光”消失为止。通过关闭孔径光阑，可以提高样品的对比度，但分辨率会降低。您应该根据自己的眼睛和所观察的标本找到一个平衡点。

就这样-五个简单的步骤。

总而言之-关闭视场光阑，聚焦边缘，将斑点居中，打开视场光阑并减少耀斑。